分光光度計中比色法詳述

　　分光光度計是一種使選定波長的電磁輻射通過溶液并測量溶液吸收(不允許通過)或透射(允許通過)的電磁輻射量的儀器。一種類型的分光光度計使用紫外線 (UV) 波長;例如，這些是導致曬傷的波長。另一種類型使用紅外 (IR) 波長，這是最常見的熱量。您可能有機會在另一門課程中使用其中一個。我們將在本課程中使用的第三種分光光度計使用可見波長，我們將其視為不同顏色的光，從紫色到紅色。由于這些是熟悉的顏色，因此這種類型的分光光度計被稱為“色度計”。

　　比色法是一種程序，其中使用比色計以兩種方式之一分析溶液的成分，如下所述。我們也可以稱之為可見分光光度法，因為我們使用的是可見波長。紫外分光光度法和 紅外分光光度法將分別使用紫外或紅外波長;當然，這些需要不同的儀器。

　　電磁輻射被吸收的現象在很多方面已經為您所熟悉。例如，將皮膚暴露在陽光下足夠長的時間會產生“曬傷”。這是皮膚細胞內的分子吸收陽光中的紫外線輻射的結果。涂抹在皮膚上的防曬霜的目的是提供其他分子在紫外線輻射到達皮膚之前吸收它。重點?分子確實會吸收電磁輻射，并且可以檢測到這種吸收。曬傷很痛!在另一個熟悉的例子中，食物中的水分子吸收微波爐中的微波輻射(紅外線長端的波長)。很容易發現的結果是食物變熱了!

　　假設我們在一杯水中加入一滴綠色食用色素，在另一杯水中加入一滴黃色食用色素。這些食用色素(染料)中的每一種都是不同類型的有機分子。想象一下將這兩種溶液放入單獨的試管中，并將它們放在窗戶燈上。您將它們視為不同的顏色，因為溶液中的染料分子會吸收(即濾除)不同波長的光，并將不同波長的光透射(即允許通過)到您的眼睛。綠色溶液看起來是綠色的，因為這種染料分子主要吸收綠色以外的波長。同樣，黃色溶液呈現黃色是因為溶液中的分子不吸收光譜中黃色部分的波長; 因此，主要是黃色波長在通過溶液后到達您的眼睛。因此，被吸收的光的質量(質量意味著類型、種類)取決于溶解在溶劑中的分子類型。不同類型的分子，例如綠色染料與黃色染料，將吸收不同類型(波長)的光。

　　吸收的光量取決于吸收光的溶解溶質的濃度 。如果增加溶質的濃度，將吸收更多給定波長的光。再次使用食用染料的例子，每杯水兩滴綠色染料會產生比只用一滴綠色染料制成的溶液略深的綠色。兩種溶液都吸收相同的非綠光波長，但在更濃的溶液中吸收的非綠光量更大。溶液吸收(或透射)光的質量和數量之間的區別是生物學中的一個重要區別：定性特性或現象(什么種類或類型)與定量特性或現象(多少/多少)。

　　在某些類型的實驗室測試中，研究人員想知道光譜的哪些波長被溶液中的溶質吸收。這可能有助于識別溶質，因為不同類型的分子吸收不同的波長。請注意，每種顏料都有不同的波長分布，它們或多或少會強烈吸收。該輪廓是“峰”和“谷”的痕跡，有些峰的斜坡上可能有“肩部”。了解吸收光譜是光吸收(因變量)隨波長(自變量)變化的曲線圖。同樣，可以根據其吸收波長的特征分布(模式)來識別一種分子。

　　在其他類型的實驗室測試中，研究人員希望確定溶液中特定溶質的濃度。在這種比色法的應用中，目標溶質的吸收光譜已經確定。因此，在色度計上，我們選擇已知溶質強烈吸收的波長。參考吸收光譜圖再次，對于稱為藻紅蛋白的色素，565 nm 將是最佳波長。我們可以說這是藻紅蛋白吸收光譜中最高“峰”的波長位置?，F在再次使用那個綠色染料的例子，一系列含有不同濃度染料的試管都會顯示為綠色，但綠色的深度不同。這意味著這些溶液都會吸收相同波長但數量不同的光。您的眼睛可以看到管之間綠色深度的相對差異，但色度計會為您量化這些差異，也就是說，將數值分配給進入溶液的光有多少 被吸收以及有多少被透射。被溶液吸收的給定波長的光的相對量稱為吸光度 (A)，而進入溶液中不受阻礙地通過的光的比例稱為透光率百分比 (%T)。